質問:
MinIONシーケンス実行の歩留まりをどのように改善できますか?
gringer
2017-05-31 14:48:19 UTC
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これは、ナノポアコミュニティ内でよく寄せられる質問です。 Oxford Nanoporeは現在、10〜15ギガベースの実行収量を生成できると主張しています(たとえば、こちらこちらを参照)が、ユーザーが管理しているのは1〜5ギガベースの範囲。

では、なぜ歩留まりに大きな違いがあるのでしょうか。

三 答え:
#1
+12
gringer
2017-05-31 15:02:35 UTC
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PoreCampAU2017でのJoshQuickの講演に参加しました。そこでは、良好なシーケンスの歩留まりと長い読み取り長の両方を実現するためのいくつかの一般的な障壁について話し合いました。それは主に、サンプル準備にもっと注意を払うことに要約されます。 MinIONはまだ汚れたサンプルをシーケンスし、歩留まりが低下することを覚えておいてください。その講演からの私のメモは次のとおりです。

  • MinIONシーケンスで最も難しいのは、最初にサンプルを取得することです
  • さまざまなサンプルタイプと抽出方法がたくさんあります
  • 入力したものよりも長い読み取りを取得することはできません。たわごとはたわごとにつながる
  • DNAは動かないときは非常に安定していますが、横方向の損傷には非常に敏感です
  • DNA抽出のフェノールクロロホルム法は非常に優れており、抽出を容易にするフェーズロックゲル
  • 単純な塩+アルコール抽出が抽出に最適な方法である可能性があります(DNAへの作業が最小限で済むため)
  • EDTA (たとえば、TEバッファー、および多くの抽出キットに見られるように)ラピッドキットと互換性がありません
  • Joshの研究室で作成された最も一貫して優れたNanoporeランは、R9.4での1Dライゲーションランでした。全体としての最良の実行は、フェノール-クロロホルム抽出+迅速なキットでした
  • ジョンタイソンは、(ソフトウェアを介して)低収量の穴から自分自身を調整することができます
  • 少数の短い読み取りを取得することは非常に重要
  • 推奨される(そしてほとんどテストされていない)精製技術:スピンカラム(60-100kb);エタノール抽出(100-150kb)、透析(150-250kb);低融点アガロースプラグ(〜1Mb、その場でのDNA抽出)
  • ナノポアプロトコル入力はナノグラム単位ですが、実際にはモル濃度として記述する必要があります。キットは、約0.2pmolの入力を想定しています
  • 膜の表面につながれた画像分子。次に、フローセル密度がシーケンスの長さに依存しないことがわかります
  • Tapestation、Qubit、Nanodropはすべて良いアイデアです。 3つのテストすべてに合格できるDNAサンプルが適切に機能します。Tapestationによる短い肩はなく、Qubitによる十分なDNA、Nanodropによる高純度
  • RNAはシーケンスを妨げる可能性があります。 RNAを消化することをお勧めします
  • DNAを凍結することは本当に悪い考えです。氷の結晶はDNAを細かく刻むのに非常に優れています
  • 冷蔵庫に保管されているDNAは非常に安定しています。 2年以上(おそらく無期限に)保持できます

収量の更新:

2018年6月に実行され、PCRから約300万回の読み取りが行われました-増幅されたマウスcDNA(約1kbのN50を読み取る)、それが誰かによって準備された最初のサンプルである状況で、入力されたDNA量はおそらく本来の約20%であり、データ損失の事件に見舞われました。それが悪い実行で起こったのであれば、将来の実行に大いに期待しています。

2018年8月の次のcDNA実行では、約700万回の読み取りと同様の読み取りN50が生成されました(つまり、総収量は約7Gb)。実行は最初の夜にWindowsUpdateによって中断され(以前は自動更新を無効にしましたが、再度有効になりました)、シーケンスの歩留まりを向上させるために、ソフトウェアとハ​​ードウェアの更新が追加されました。優れたフローセルと同様のサンプル準備があれば、次に実行するcDNAの実行で800万回以上、場合によっては1,000万回以上の読み取りが行われると予想されます。

#2
+2
roblanf
2017-06-10 08:52:26 UTC
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私の賭けは、ナノポアの人々が(もちろん!)2つの重要なことについて大量の最適化を行ったことです:

  1. DNAのクリーンアップ
  2. ライブラリの準備
  3. ol>

    ほとんどのDNA抽出では、クリーンアップは大きく異なる可能性があると思いますが、Blue Pippinのようなものは、アクセスできて使用できる場合は例外的な仕事をします(機能しません)。もちろんゲルを通過できないSUPERの長いDNA断片の場合)。ブルーピピンはサイズの選択も行うので、毛穴を焼き尽くしてたくさんの小さなものをシーケンスする必要はありません。これも歩留まりに役立つはずです。

    それはすべてライブラリの準備にかかっており、@ gringerの答えにはそれに関するいくつかの良いヒントがあります。

#3
+1
Saidi Rahina Hussain
2018-10-27 01:28:34 UTC
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私は真菌を使用しており、DNA抽出にCTAB法を使用しており、最初のライブラリー調製にラピッドキットを使用しましたが、機能しませんでした。ライゲーションキットを使用していたため、非常に良い結果が得られました。 。 4GBから13GBの範囲のデータを取得できました。



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